Dasar Teori Perwarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana adalah suatu metode pewarnaan umum dimana dapat digunakan beberapa larutan tunggal zat warna dengan tujuan untuk melihat bentuk-bentuk sel bakteri.Teknik ini digunakan untuk melihat bentuk-bentuk morfologi sel bakteri ( coccus,basil,spiral dll ) dan susunan bakteri tersebut ( tunggal,berantai,berpasangan ).Dalam teknik ini hanya menggunakan satu zat yang bersifat basa karena sel bakteri bersifat basofilik ( suka akan basa ).Zat warna yang bersifat basa diantaranya methlyn blue,kristal violet dan karbol fuchsin.

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain.

Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.

Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni sebagai berikut:

• mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. 
• Mempersiapkan apusan, apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat. Biakan Cair. 
• Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. 
• Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar +- 3 cm. Biarkan mengering diudara atau diatas api kecil dengan jarak 25 cm.

Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu dengan jarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranya dengan cara memanaskan diatas api.

Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk:

- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa (Suriawiria, 1985).

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah:

• - Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
• - Fiksasi olesan pada kaca objek.
• - Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (Pelczar, 1986).
• Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk:
• - Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
• - Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
• - Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
• - Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1985).

Beberapa cara pengecetan, yaitu:

- Pengecetan negatif

- Pengecetan sederhana

- Pengecetan gram

- Pengecetan ziehl nielsen

- Pengecetan kapsul

- Pengecetan spora

- Pengecatan flagella

Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe mofrologi (kokus, basilus, vibrio, dan spirilum).

Safranin adalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi . Safranin digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan, mewarnai semua sel inti merah. Hal ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi kartilago, musin dan tiang sel butiran.

Safranin biasanya memiliki struktur kimia yang ditunjukkan di sebelah kanan (kadang-kadang digambarkan sebagai safranin dimetil). Ada juga trimetil safranin, yang memiliki menambahkan grup metil pada posisi-orto dari cincin yang lebih rendah. Kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dalam aplikasi pewarnaan biologis, dan sebagian besar produsen safranin tidak membedakan antara keduanya. Persiapan safranin Komersial sering mengandung campuran dari kedua tipe. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam kimia analitik .

Safranin juga merupakan azonium dengan senyawa dari simetris 2,8-dimetil-3 ,7-diamino-phenazine. Mereka yang diperoleh bersama oksidasi satu molekul dari diamina-butir dengan dua molekul dari amina primer ; oleh kondensasi senyawa-aminoazo para dengan amina primer, dan oleh aksi para-nitrosodialkylanilines dengan sekunder dasar seperti diphenylmetaphenylenediamine. Mereka kristal padatan hijau metalik menunjukkan karakteristik keharuman , mereka mudah larut dalam air dan pewarna biru atau ungu. Mereka adalah bentuk dasar yang kuat dan stabil monacid garam. Hal ini dapat mudah diazotized, dan garam diazonium ketika direbus dengan hasil alcohol.

CARA KERJA  :   B.1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

Cara Kerja :

• · Bersihkan object glass dengan kapas
• · Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
• · Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata.
• · Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)
• · Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.
• · Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue
• · Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10)

V. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum kali ini kita dapat menarik kesimpulan sebagai berikut:

1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative.

2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.

3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.

4. Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen

DAFTAR PUSTAKA

• Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
• Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
• Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada hari Senin, 13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA.
• Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
• Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
• Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga
•